Mehr vom Raster-Elektronen-Mikroskop

Das Auflösungsvermögen des REM wird in erster Linie vom Durchmesser des abtastenden Primärelektronenstrahls bestimmt, aber auch von der Eindringtiefe des Strahls in die Probe, die wiederum von der Materialbeschaffenheit der Probe und von der gewählten Beschleunigungsspannung der Primärelektronen abhängt. Beim Eindringen des Strahls erfährt dieser eine erhebliche Verbreiterung. Da die zur Abbildung benutzten Sekundärelektronen aber auch aus größeren Tiefen (bei biologischem Material bis zu l0 nm), d.h., auch aus dem Verbreiterungsbereich, an die Oberfläche austreten können, ist das Auflösungsvermögen in der Praxis schlechter als vom Strahldurchmesser her zu erwarten gewesen wäre. Es beträgt bei modernen Geräten ca. 1,5 nm. Hohe Auflösung ist auch nur dann zu erwarten, wenn der abtastende Strahl einen kreisrunden Querschnitt aufweist. Sind die den Strahl bündelnden Linsen dagegen astigmatisch, führt das zu einem elliptischen Querschnitt. Zur Kompensation dieses Astigmatismus sind in der letzten Linse des REM ebenfalls Stigmatoren eingebaut. Eine Beeinflussung des Strahlquerschnittes in der Ebene der Probenoberfläche erfolgt auch durch Beugungs-, Öffnungs- und Farbfehler in den strahlbündelnden Kondensorlinsen. Insofern wird von diesen Abbildungsfehlern das Auflösungsvermögen beeinflusst, obwohl die eigentliche Abbildung des Objektes ohne Linsen geschieht. Da im Raster-Elektronenmikroskop die Probe üblicherweise gegenüber der optischen Achse geneigt ist, kommt es zu einer Größenverzerrung senkrecht zur Kippachse. Auf dem Bildschirm sind alle Objektdimensionen, die parallel zur x-Achse liegen, proportional zur Vergrößerung richtig dargestellt, während die von dieser Richtung abweichenden Objektdetails winkelabhängig verkleinert wiedergegeben werden. Diese Bildverzerrung muss bei morphometrischen Analysen berücksichtigt werden. 

Das REM ist hinsichtlich seiner Einsatzmöglichkeiten und seines Informationsgehaltes einem Auflichtmikroskop ähnlich. Auch die Möglichkeit des großflächigen Absuchens der Oberfläche ist bei beiden Verfahren gegeben. Lebendbeobachtungen sind nur im LIMI möglich. Auflösungsvermögen und damit maximale sinnvolle Vergrößerung des REM liegen aber deutlich über denen des LIMI. Auch die Schärfentiefe ist beim REM erheblich größer als beim LIMI.

( Harald Rühling mit Auszügen aus "Fromme 1980")

Wegen der völlig anderen Art der Bildentstehung im REM müssen die Präparate einige andere Eigenschaften aufweisen, als bei anderen mikroskopischen Abbildungsverfahren. Dazu gehört, daß die Präparate getrocknet und elektrisch leitend sein müssen.

Grundsätzlich können postmortale Strukturveränderungen sowohl durch eine chemische als auch durch eine physikalische Fixierung klein gehalten werden. Die chemische Fixierung erfolgt durch das Einwirken von Chemikalien auf die Gewebe. Bewährt haben sich Aldehyde, wie z.B. Glutaraldehyd oder Formaldehyd. Neben diesen gilt auch Osmiumtetroxid (OsO4) als ein gutes strukturerhaltendes Mittel. Die Fixation erfolgt in verdünnter wäßriger Lösung dieser Substanzen, die zur Vermeidung von Schrumpfungen bzw. Quellungen den gleichen osmotischen Druck aufweisen muß, wie das zu fixierende Gewebe (Isotonie). Weiterhin ist darauf zu achten, daß der pH-Wert der Fixierlösung mit dem des Gewebes übereinstimmt. Er sollte sich auch bei der Fixation nicht verändern. Das erreicht man durch eine wirksame Pufferung des Fixiergemisches.

Das Trocknen der Präparate durch Verdunstung des Wassers führt zu starken Strukturzerstörungen aufgrund der Einwirkung von Oberflächenspannungen. Ein Austausch des Wassers gegen Flüssigkeiten mit geringerer Oberflächenspannung (=Entwässerung) und anschließender Trocknung durch Verdunstung der Substitutionsflüssigkeit bringt nur geringfügige morphologische Verbesserungen für den Strukturerhalt. Erstrebenswert ist eine Trocknung, bei der die Oberflächenspannung überhaupt nicht auftreten und deshalb auch nicht stören kann. Diese Bedingungen findet man vor, wenn aus Flüssigkeit jenseits ihres "kritischen Punktes" getrocknet wird, wobei in einem geschlossenen Behälter der kritische Punkt einer Flüssigkeit durch eine definierte Temperatur (kritische Temperatur) und einen dazu gehörigen definierten Druck (kritischer Druck) gegeben ist. Bei der sog. "Kritischen-Punkt-Trocknung" (KPT; englisch: CPD von "critical point drying") wird das Wasser der Proben durch Alkohol substituiert. Anschließend werden die Proben in eine Druckkammer überführt, in der der Alkohol schrittweise durch C02, das bei Zimmertemperatur bereits unter einem Druck von ca. 55 bar flüssig ist, verdrängt wird. Ist die Probe vollständig mit reinem C02 durchtränkt und umgeben, kann die Temperatur in der Druckkammer erhöht werden. Damit steigt auch der Druck in der Kammer an. Liegen Druck und Temperatur über den kritischen Werten, wird der Druck gesenkt, wobei die Temperatur weiterhin über der kritischen Temperatur bleiben muß. Sobald der Normaldruck erreicht ist, kann die Probe getrocknet entnommen werden.

Die Einsatzmöglichkeiten der REM sind nicht auf die Untersuchung der äußeren Oberfläche biologischer Proben beschränkt. Vielmehr können auch innere Oberflächen, z.B. von Hohlorganen, direkt oder indirekt abgebildet werden. Dieses geschieht entweder durch gezieltes Freilegen innerer Oberflächen (Sprödbruchpräparation) oder durch Ausgießen der Hohlorgane mit Abdruckmaterialien und an die Aushärtung anschließendes chemisches Auflösen der biologischen Gewebe (Korrosionsabdruck). Mit Sprödbrüchen lassen sich beispielsweise die Innenstrukturen von Organen darstellen. Dazu wird das Organ schockartig eingefroren und bei Temperaturen von ca. -190° C mit einem gekühlten Skalpell aufgebrochen. Danach kann das Gewebe aufgetaut, fixiert, entwässert und nach dem "Kritische-Punkt-Verfahren" getrocknet werden. In einigen Laboratorien werden die Gewebe erst chemisch fixiert und anschließend entwässert. Erst im 100%igen Alkohol erfolgt dann das Schockgefrieren und Aufbrechen der Probe. Ähnlich spröde wie bei tiefen Temperaturen sind die Gewebe auch, wenn ihnen das Wasser vollständig entzogen worden ist. So können die Proben unmittelbar nach der KPT, bevor sie Gelegenheit haben, Luftfeuchtigkeit an sich zu ziehen, mit Erfolg aufgebrochen werden. Mit Hilfe der Korrosionsabdrücke können z.B. Blut- und Lymphgefäße eines Organs oder die Lumina der Atemwege einer Lunge bis in die Alveolen dargestellt werden. Vor dem Füllen der Hohlräume mit monomeren Kunststoffen werden die Gewebe bzw. Organe mit einer Salzlösung gespült. Nach erfolgter Polymerisation wird das Gewebe mit Natronlauge aufgelöst. Der Kuststoffabdruck wird getrocknet, auf einen Objekthalter montiert, mit Edelmetall beschichtet und mikroskopiert.

In der REM werden massive Metallplättchen, die mit einem Fuß in eine entsprechende Öffnung des Präparattisches gesteckt werden, als Objektträger benutzt. Die Montage der Präparate geschieht im allgemeinen durch Aufkleben mit Klebern, die schnell trocknen und im Vakuum nicht gasen. Es hat sich bewährt, hierfür Klebstoffe zu verwenden, die elektrisch leitend sind. Dazu gehören z.B. Leit-Silber und Leit-Carbon. Kleine Objekte neigen dazu, in der Klebemasse zu versinken. In solchen Fällen verwendet man besser doppelt-beschichtete Klebefilme, auch wenn diese elektrisch nicht leitend sind. Bei der Montage muß bereits berücksichtigt werden, daß die interessierenden Strukturen vom abrasternden Primärstrahl erreicht werden können, d.h. nach oben gekehrt sein müssen.

Elektrisch nichtleitende Proben laden sich durch das Eindringen des abtastenden Elektronenstrahls auf. Die dabei entstehenden elektrischen Ladungen stören die Abbildung erheblich. Es muß demnach dafür gesorgt werden, daß die elektrische Ladung abfließen kann. Eine Voraussetzung dafür stellt der metallische Probenhalter dar, der in dem geerdeten Präparattisch steckt. Eine sehr gute Leitfähigkeit der biologischen Proben erhält man durch das sog. "sputter-coating", bei dem Metallatome auch in Nischen und tieferen Ritzen der Präparate abgelagert werden. Bei diesem Verfahren prallen durch Gasentladung erzeugte Argonionen auf eine Goldkathode (Platin), aus der sie Goldatome herauschlagen. Diese lagern sich u.a. auf der Probenoberfläche ab und bilden eine gut leitende und zusammenhängende Metallschicht, die im Idealfall so dünn ist, daß sie unter dem Auflösungsvermögen des Mikroskops liegt.